آنتوسيانين
براي تهيه نمونه آنتوسيانين، 1 گرم از بافت له شده در لوله آزمايش ريخته و دور لوله آزمايش را با كاغذ آلومينيومي پوشانده شد. سپس اسيد و الك با نسبت الكل 96 درصد (99 ميليليتر) و يك ميليليتر اسيد كلريدريك به آن اضافه شد و پس از نگهداري در يخچال بهمدت 24 ساعت، صاف شد و ميزان جذب آنتوسيانين در طول موج 512 نانومتر قرائت شد. براي شاهد يا بلانك هم از اسيد + الكل به نسبت ذكر شده استفاده گرديد.
منبع: بررسي تاثير برش غده و تيمار با اتيلن بر تعداد و طول جوانهها و تغييرات ميزان آنتوسيانين، آميلاز و محتواي كلروفيلي غدههاي سيبزميني. كامبيز مشايخي، بهنام كامكار و رضوان خسروي
اندازهگيري آلفاآميلاز
ابتدا يك گرم از بافت تر گياه با 20 ميليليتر بافر فسفات 10 ميليمولار با 2/7=pH که حاوي 50 ميليمولار NaCl ميباشد در دماي اتاق در داخل هاون چيني ساييده شد. سپس محلول حاصل به لوله سانتريفوژ انتقال داده شد. بهمدت 24 ساعت لوله حاوي نمونه روي شيکر همزده شد. سپس لوله بهمدت 35 دقيقه در rpm 2000 سانتريفوژ شد. پس ازسانتريفيوژ، فاز بالايي به درون لوله آزمايش منتقل شد و رسوبات باقيمانده نيز با افزودن 10 سيسي ماده فوق بهمدت 2 ساعت روي شيکر قرار داده و پس از سانتريفيوژ، فاز بالايي آن به لوله اول منتقل شد. در صورت انجام نشدن آزمايش در همان روز در دماي 20- درجه سانتيگراد نگهداري ميشود. بعد از آن نيم ميليليتر آنزيم داخل محلول بافر بهعلاوه نيم ميليليتر محلول نشاسته 1 درصد مخوط شده و بهمدت 15 دقيقه در دماي 100 درجه سانتيگراد قرار داده شد. بعد بهمدت 3 دقيقه در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده و سپس واکنش با افزودن 3 ميليليتر معرف دي نيترو ساليسيليک اسيد متوقف گرديده و بهمدت 5 دقيقه در بنماري در دماي جوش قرارداده، بعد لولهها را سرد کرده و 1 ميليليتر تارتارات سديم پتاسيم اضافه کرده و مقدار فعاليت آنزيم با طول موج 510 نانومتر قرائت ميشود.
استخراج عصاره از برگ گیاه
ابتدا برگها در محیط آزمایشگاه و در دمای طبیعی خشک شده سپس در آسياب بهصورت پودر در آمدند. نمونههای پودر شده وزن شده و مقدار 5 گرم از پودر نمونه در ارلن 50 میلیلیتری ریخته شد و سپس به آن 50 سیسی متانول 80 درصد اضافه شد (نسبت نمونه به محلول متانولی 1به 10 باید باشد). پس از 24 ساعت با استفاده از کاغذ صافی محلول متانولی حاوی نمونه صاف شد. پس از آن محلول متانولي را به دستگاه روتاري براي خارج كردن متانول از عصاره انتقال دادیم. پس از تبخیر متانول در دستگاه، عصاره خالص در ظرف كوچكي ريخته شد و براي اندازهگيري فنل ، فلاوونوئيد و فعاليت آنتي اكسيداني استفاده شد.
اندازهگیری آنتی اکسیدانت به روش DPPH
میزان مهار رادیکالهای دی پی پی اچ (DPPH)، با روش ابراهیمزاده و همکاران (2008) مورد ارزیابی قرار گرفت. ابتدا از عصاره بالا 40 ميليگرم وزن نموده در 25 سيسي متانول حل کردیم. وزن مورد نظر را برداشته در مقدار كمي متانول حل کرده سپس به حجم 25 سيسي با متانول رساندیم. چون عصاره چسبناك است و وزن كردن آن سخت است پس اول بالن 25 سيسي روي ترازو صفر كرديم و نمونه را در آن مي ريزيم. دقت ترازو براي اين كار بايد تا 4 رقم اعشار باشد.
در اين مرحله راديكال پايدار دي فنيل پيكريل هيدرازيل يا DPPH را به غلظت 4 ميليگرم در 100 سيسي متانول حل ميكنيم (0.1 میلی مولار). سپس براي هر عصاره 5 غلظت بايد ساخته شود. برای این منظور، محلولهائی با غلظتهای 500-5/12 میکروگرم در میلیلیتر از تمامی عصارهها در حلال متانول آماده شدند. پس 5 لوله انتخاب ميكنيم. ابتدا در همه لولهها 2 سيسي DPPH ميريزيم. سپس 2 سیسی عصاره به DPPH اضافه میکنیم. پس 5 لوله با غلظتهای متفاوت عصاره و DPPH یکسان داریم. بعد از اين كار لولهها بهمدت 15 دقيقه در محيط تاريك قرار ميگيرد و در طول موج 517 نانومتر خوانده ميشوند. علاوه بر لولههاي مذكور يك لوله براي شاهد در نظر ميگيريم اين لوله ماكزيمم جذب را دارد و فقط 2سيسي DPPH و 2 سیسی متانول دارد. اسپكت بايد با متانول صفر شود.
معمولا رنگ لولهها در جهت افزايش غلظت از ارغواني به زرد است. يعني غليظترين لوله كه بيشترين عصاره را دارد زرد است و كمترين غلظت ارغواني است و مربوط بهDPPH است. اعداد زير توسط فرمول زير به درصد مهار تبديل ميشود: عدد جذب نمونه را از عدد شاهد كم كرده و بر عدد شاهد تقسيم ميكنيم بنابراين براي هر جذب يك درصد مهار داريم (از هر نمونه 5 غلظت خوانده شد پس 5 درصد مهار داريم). در انتها 5 عدد بهدست آمده در اكسل تشكيل يك شيب خط را ميدهد. از فرمول بهدست آمده يا همان شيب خط بدست آمده y درصد جذب مهار است و X غلظت بوده و مجهول ما ميباشد.
= درصد مهار رادیکالهای آزاد (DPPH)
1/0 |
2/0 |
4/0 |
8/0 |
6/1 |
غلظت |
7/5 |
4/16 |
7/38 |
4/62 |
8/92 |
درصد مهار |
با بهدست آمدن اين خط براحتي ميتوان محاسبه كرد كه اگر درصد مهار ما 50 باشد غلظت چقدر است به اين عدد IC50 گويند. در واقع IC50 غلظتي را نشان ميدهد كه در آن درصد مهار 50% است و واحد آن ميليگرم بر ميليليتر است. IC50 را توسط ماشين حساب ميتوان حساب كرد X ها و Yها را به دستگاه داده و در نهايت با دادن عدد 50 بجاي y ، مي توان x را حساب كرد. در مقاله ميانگين غلظت مهار 50% IC50 در عصاره متانولي بر اساس ميليگرم بر ميليليتر گزارش ميشود.
باید دقت کرد که 5 عدد بهدست آمده برای درصد مهار به گونهای باشد که عدد 50 (نه لزوما عدد 50) را هم شامل شود، بهعنوان مثال در جدول بالا بین اعداد 38.7 و 62.4 عدد 50 هم وجود دارد، در حالیکه اعداد 79،83،94،95،99 دارای محدوده نادرستی میباشند. علت این امر بالا بودن غلظت عصاره است، بدین منظور باید یک نمونه جهت تست نمودن که دارای محدوده وسیعی از غلظت بالا تا پایین باشد (12.5 تا1000 میکروگرم بر میلیلیتر) تا غلظتهای مناسب جهت بهدست آوردن درصد مهار بدست آید. در صورتی که از اعداد با محدوده بالا تر از 50 استفاده شود، IC50 بهدست آمده از این معادله خط منفی میشود، که نادرست است.
اندازهگیری فنل کل
اندازهگیری فنل کل از روش ابراهیمزاده و همکاران (2008) انجام شد. تهيه عصاره به روش قبلي است. بعد از گرفتن عصاره 0.5 سيسي عصاره متانولي (40 ميليگرم در 25 سيسي) را با 5 سيسي فولين سيوكالتيو (1 به 10 رقيق شده با آب مقطر) مخلوط ميكنيم سپس 4 سيسي كربناتسديم يك مولار (10.6 گرم در 100 سيسي آب مقطر) اضافه ميكنيم. براي شاهد نيز بجاي عصاره خشك، متانول كه حلال است ريخته ميشود و بعد فولين سيوكالتيو و كربناتسدیم اضافه ميگردد. از اين محلول براي صفر كردن اسپكتروفتومتر استفاده ميشود. محلول فوق بايد 15 دقيقه در تاريكي قرار گيرد و بعد در طول موج 765 نانومتر خوانده شود. عصاره متانولي را ميتوان كمتر درست كرد مثلا 40 ميليگرم در 25 سيسي متانول. با استفاده از استاندارد گالیک اسید منحنی کالیبراسیون رسم میشود. معادلهای که بهدست میآید مشابه معادله y=0.0063X است.
در اينجا y همان عددي است كه در مقابل بلانك خوانده ميشود از اين طريق x بهدست ميآيد. چون غلظت عصاره 40 ميليگرم عصاره خشك در 80 سيسي و يا بهعبارت ديگر 1600 ميليگرم در ليتر يا 1.6 گرم در ليتر بوده است. بايد اين x را براي 1 گرم در ليتر حساب كرد. كه در اينجا x دوم بهدست آمده بهعنوان محتواي فنلي و بر حسب اكيوالان گاليك اسيد در يك گرم عصاره خشك بهدست ميآيد.
اندازهگيري محتواي فلاونوئيد
تهيه عصاره خشك به روش قبلي است. 0.5 سيسي از عصاره متانولي+ 1.5 سيسي متانول+ 0.1 سيسي آلومنيوم كلريد10% در اتانول(10 گرم الومنيوم كلريد در 100 سيسي اتانول و آب مقطر)+ 0.1 سيسي استاتپتاسيم يك مولار (2.41 گرم در 10 سيسي آب مقطر)+ 2.8 سيسي آب مقطر. براي تهيه شاهد نيز بجاي عصاره متانولي، متانول خالص ميريزيم. سپس مخلوط در نيم ساعت تاريكي قرار گرفته و در طول موج 415 نانو متر خوانده ميشود. اعداد بهدست آمده براي فنل و فلاونوئيد بايد با رجوع به منحني استاندارد تبديل بهميزان واقعي شوند. براي اين كار بدين صورت عمل ميشود. بهعنوان مثال اگر معادله منحنی استاندارد ما y= 0.0067x+0.0132 باشد،
Y همان جذب خوانده شده توسط بلانك است. در اينجا x را بهدست آورده و سپس در يك تناسب براي 1 گرم در ليتر عصاره محاسبه ميشود و بر اساس اکیوالان کوئرستین در یک گرم عصاره خشک گزارش میشود.
اندازهگیری کلروژنیک اسید و کافئیک اسید با استفاده از دستگاه HPLC
بهمنظور اندازه گیری کلروژنیک و کافئیک اسید از کروماتوگرافی با کارایی بالا استفاده شد. HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت ممکن است جامد و یا مایع باشد و فاز متحرک مایع است.
مدل دستگاه استفاده شده مرک- هیتاچی است. که شامل تجهیزات زیر میباشد:
- پمپ : لاکروم
- مدل ل- 7100
- دتکتور : UV
- ستون : C-18 با ابعاد 6/4 × 250 میلی متر
- اندازه ذرات : 5 میکرومتر
نمونهها با سرعت جریان یک میلیمتر در دقیقه در طول موج 280 نانومتر اندازهگیری شدند. فاز متحرک شامل استونیتریل به میزان 10 میلیلیتر به اضافه 1 میلی لیتر اسیداستیک و 89 میلیلیتر آب مقطر دیونیزه میباشد.