ه) سانتريفوژ، يخچال، ميكروسكوپ، دستگاه pH سنج، دستگاه لرزاننده ٣، لامپ ماوراء بنفش و ساير ابزار آلات در آزمايشگاههاي كشت بافت لازم مي باشند.
و) گلخانه سازگاري : نمونه هاي گياهي پس از رشد كافي، ريشه دار شدن و انتقال به گلدان حاوي بستر استريل، درون گلخانه اي كه شرايط محيطي به ويژه رطوبت نسبي در آن كنترل مي شود، به تدريج به شرايط غيراستريل و هواي غيراشباع از رطوبت سازگار مي گردند.
روشهاي ريزازديادي به هر صورت، اعم از كشت مريستم، كشت بافت و يا كشت تعليقي ياخته ها بدين ترتيب انجام مي پذيرد كه ابتدا اندامي از گياه را كه مي خواهند از آن نمونه بگيرند (مانند نوك ساقه، برگ و غيره) تعيين كرده، قطعه بسيار ريزي از آن جدا شده و پس از ضد عفوني سطحي با موادي مانند هيپوكلريت سديم يا مواد سفيد كننده معمولي، چند بار با آب مقطر مي شويند. سپس نمونه را بر روي محيط كشتي كه قبلا آماده شده در ظروف كاشت قرا ر مي دهند. محيط كشت ممكن است مايع باشد يا به وسيله آگار نيمه جامد باشد . اين محيط شامل مواد معدني ، قندها ، ويتامينها و مواد تنظيم كننده رشد است . پژوهشگران فرمولهاي غذائي مخصوصي را به منظورهاي مختلف، پيشنهاد كرده اند كه معمولا هما نها را عينا يا با تغييراتي جزئي استفاده مي كنند. نمونه هاي گياهي كه در ظرف كاشت قرار دارند بايد پس از مدتي (كه طول آن بستگي به نوع گياه دارد) ، جهت توليد ريشه يا ساقه، به محيط كشت تازه و يا محيط كشت ديگري منتقل گردند . براي انتقال به خاك نيز بايد قبلا گياهاني را كه در ظروف كاشت، ريش هدار شد هاند، به تدريج با محيط خاك و گلخانه عادت داد. آينده كشت بافت نويد بخش تحولات متعدد و جالبي در كشاورزي است . ذيلا چند روش ريز ازديادي، به اختصار شرح داده خواهد شد:
كشت نوك ساقه
از آنجايي كه نقاط مريستمي گياه غالبا عاري از عوامل بيماري زا، نظير ويروسها مي باشد، از اين روش براي ايجاد همگرو ههاي عاري از عوامل بيماريزا استفاده مي شود. در اين روش ، سرشاخ ه اي به طول چند سانتي متر ، كه داراي چندين برگ باشد را جدا ساخته و پس از ضدعفوني و شستشو، برگهاي بزرگ آنرا قطع مي كنند. سپس در محيطي عاري از ع وامل بيماريزا، به دقت برگهاي كوچكتر و برگ هايي كه دور تا دور مريستم انتها يي را فرا گرفته اند برم ي دارند تا برجستگي انتها يي ظاهر شود .
از مريستم انتهائي قطعه اي به اندازه 2/0 تا 5/0 ميليمتر كه شامل انتهاي شاخه و يك يا چند برگ زير آن مي باشد برداشته مي شود و مستقيما بر روي محيط كشت نيمه جامد و يا كاغذ صافي، كه براي انتقال مواد غذايي در داخل محلول كشت مايع نهاده شده، قرار داده مي شود. در محيط كشت، مواد معدني، قند و بعضي ويتامينها (مانند تيامين) و ماده تنظيم كننده ي سيتوكينين وجود دارد. سيتوكينين براي افزونگري و توليد شاخساره هاي متعدد از يك ريزنمونه ضروري مي باشد شروع ريشه زايي، با استفاده از يك اكسين مناسب مانند اسيد ايندول بوتيريك يا اسيد نفتالين استيك تحريك مي شود . پس از آنكه ريشه دهي شروع شد نمونه به محيط عاري از اكسين انتقال داده مي شود . لوله هاي آزمايشي محتوي نمونه هاي گياهي را در نور و دماي متوسطي نگهداري مي كنند و پس از 4-3 هفته زماني كه ريشه ها به اندازه كافي رشد كردند به خاك انتقال مي دهند.
كشت پينه
براي كشت پينه ابتدا با استفاده از يكي از اندام هاي گياهي، تعداد زيادي ياخته اختصاصي نشده به نام پينه، تحت شرايط عاري از عوامل بيماريزا ايجاد مي گردد. مرحله اول شامل توليد پينه و رشد دادن آن است . در مرحله دوم سعي در اختصاصي كردن و ايجاد تنوع در ياخته و متعاقبا توليد اندامهاي گياهي و بالاخره پديد آوردن يك گياه كامل مي گردد . ايجاد ريشه و شاخ و برگ در پينه، براي گياهان علفي (مانند هويج، تنباكو و شمعداني) به آساني انجام مي پذيرد ولي در مورد گياهان چوبي كمتر موفقيت آميز بوده است . محيط كشت توليد پينه محتوي مواد معدني، قند، ويتامين و مواد تنظيم كننده رشد مي باشد. معمولا پينه در تاريكي بهتر از روشنايي رشد مي كند ولي براي تنوع يافتن و اختصاصي شدن ياخته ها نور لازم است. پس از آنكه اندازه پينه با تقسيم سلول ي بزرگ شد آنرا به قطعات كوچك تقسيم كرده و روي محيط كشت تازه قرار مي دهند. براي تو ليد شاخ و برگ، قطعه اي از پينه را بر روي محيط محتوي سيتوكينين يا آدنين قرار داده و پس از آنكه جنين رويشي بر روي آنها ايجاد گشت و توليد شاخ و برگ كرد آنها را به محيط كشت ديگري كه حاوي آكسين مي باشد قرار مي دهند، تا ريشه دار شوند . گياهان كوچك ريشه دار را پس از آماده كردن، مانند گياهاني كه بطريق معمولي تكثير شده اند براي سازش با خاك و محيط گلخانه رشد مي دهند.
كشت جوانه يا گره
در واقع هدف از اين روش استفاده از ريزنمونه ي حاوي جوانه جانبي يك ساقه مي باشد . بنابراين ريزنمونه را از قطعه اي از ساقه كه دا راي يك جوانه جانبي مي باشد انتخاب مي كنند . طول اين ريز نمونه ممكن است به يك سانتي متر برسد . از آنجايي كه جوانه رويشي در واقع يك ساقه بسيار كوچك و فشرده در درون فلس هاي كوتيني مي باشد، آمادگي بهتري براي رشد و توليد يك شاخساره دارد . مشكل اصلي در اين شيوه، دشواري استريل كردن ريز نمونه مي باشد . زيرا فلس هاي جوانه و كرك هاي موجود بر روي ساقه، استريل سطحي را گاهي غير ممكن مي سازد . روش هاي آماده سازي مناسب و يا استفاده از شاخساره هاي استريل حاصل از رويش دورن شيشه اي راه حل هاي فايق آمدن بر اين مشكل مي باشند . پس از تهيه و آماده سازي ريز نمونه، شيوه ي عمل تقريبا مشابه روش كشت نوك ساقه مي باشد.
ازدیاد رقم
از آنجايي كه حفظ ژنوتيپ، لازمه ي حفظ يك رقم ميوه مي باشد، از اينرو بدون استثناء بخشي از درخت كه مسئول توليد ميوه مي باشد بايد به شيوه ي غيرجنسي ازدياد يابد . اين شيوه ي ازدياد ممكن است از طريق ريشه دار كردن قلمه هاي خود رقم خوراكي باشد (مثل درخت توت سفيد) كه اين نوع درخت را خود ريشه ١ مي نامند . اين شيوه ازدياد هرچند كه عملي مي باشد ولي در توليد تجاري ميوه مرسوم نيست . زيرا در اين صورت بدون استفاده از يك درخت تركيب ي پيوندي، از مزاياي پايه مناسب بي بهره خواهيم بود . ضمن اينكه كمتر رقمي از درختان ميوه وجود دارد كه در عين مطلوبيت ميوه، خاصيت پاي هاي خوبي نيز داشته باشد. روش مرسوم ازدياد رقم، در نهالستان ها استفاده از پيوند مي باشد . پيوند زدن عبارت است از متصل كردن دو قسمت گياهي (مانند ساقه و ريشه يا دو ساقه مختلف) به نحوي كه آن دو قسمت، توسط باززائي در محل اتصال، با هم يكي شده به عنوان گياهي مستقل، به رشد ادامه دهند . قسمتي كه در بالاي محل پيوند قرار مي گيرد پيوندك و قسمت زيرين كه ريشه را تشكيل مي دهد پايه خوانده مي شود. هرگاه پيوندك از يك شاخه حاوي چند جوانه تشكيل شده باشد به آن پيوند شاخه گويند و هر گاه تنها از يك جوانه به انضمام اندكي از پوست چوب تشكيل شده باشد، آنرا پيوند جوانه مي نامند. بعضي اوقات قطعه اي از ساقه كه ميان پايه ٦ ناميده م ي شود، بين پايه و پيوندك قرار مي گيرد . استفاده از ميان پايه از زمانهاي پيش معمول بوده است و از قرنها پيش دانسته شده كه مثلا در درختان ميوه قرار دادن يك ميان پايه كوتاه كننده، بين يك پايه پر رشد و يك پيوندك پر رشد، باعث توليد گياهان پاكوتاه با ميو ه هاي زودرس مي گردد. مزاياي پيوند زدن به قرار زير است:
الف) با استفاده از پيوند، مي توان گياهي را كه داراي ريش ه هاي ضعيفي است بر روي پاي ه اي كه داراي ريشه قوي است قرار
داد. به همين منظور م ي توان از پاي ه هايي استفاده كرد كه در برابر شرايط نامناسب خاك مانند زهكش ي بد ، شوري و سنگيني
خاك و يا در برابر حشرات و آفات مقاوم هستند.
ب) با پيوند زدن، م ي توان از گياهاني مانند بادام، سيب و گردو كه تكثيرشان توسط ساير روشها دشوار است ، همگروه پديد آورد.
ج) به وسيله پيوند مي توانيم از مزاياي پايه هاي اصلاح شده رويشي استفاده كرد . به عنوان مثال امروزه به علت دشواري عمليات داشت و برداشت در درختان تنومند، از پايه هاي پاكوتاه كننده و نيمه پاكوتاه كننده استفاده مي شود، كه خاصيت پاكوتاهي اين پايه ها به پيوندك نيز القاء شده و در نتيجه درخت تركيبي، پاكوتاه و يا نيمه پاكوتاه خواهد شد.
د) به وسيله پيوند مي توان ارقام جديدي را با استفاده از پايه هاي قديمي جايگزين ارقام قديم ساخت . اين عمل را پيوند سرشاخه كاري گويند . مثلا مي توانيم باغي را كه داراي سيب ترش است با استفاده از پيوند سرشاخه كاري و پايه هاي قديمي به باغ سيب لبناني تبديل كنيم.
ه) با پيوند زدن مي توان چند نو ع ميوه را بر روي يك پايه به وجود آورد . مثلا ميتوان آلو، گوجه سبز و هلو را بر روي يك پايه
گوجه پيوند زد . البته اينكار ممكن است از نظر تجارتي قابل اجرا نباشد، زيرا رشد گياه مركب، بواسطه وجود پيوندك هاي متفاوت، نامناسب مي گردد. ولي بعضي مواقع مي تواند براي ر فع نياز، بهترين گزينه باشد . براي مثال در باغچه منازل شهري كه فضاي كافي براي پرورش انواع درختان ميوه فراهم نيست، روش مزبور بسيار مطلوب مي باشد.
و) با عمل پيوند مي توان مشكل گرده افشاني درختان ميوه اي نظير بادام را كه خود ناسازگاري گرده دارند، در شرايط اجبار، با پيوند كردن رقم گرده زا بر روي رقم اصلي برطرف كرد.
ز) درختان پيوندي همواره زودتر از درختان بذري و غير پيوندي، به مرحله ي باردهي مي رسند . زيرا درخت بذري براي آغاز باردهي لازم است مراحل نونهالي و انتقال را طي كرده و به مرحله بلوغ ٤ برسد . بنابراين د رختاني مثل سيب و گلابي غير پيوندي ٧ تا ٨ سال زمان مي برند تا به مرحله توليد برسند. بهترين زمان براي انجام پيوند شاخه اواخر زمستان يا اوائل بهار (با استفاده از پيوندكي كه در زمان استراحت گياه گرفته شده و در دمائي نزديك صفر درجه سانتيگراد انبار شده) و براي پيوند جوانه از اواسط بهار تا اواخر تابستان كه پايه پوست پايه به راحتي جدا مي شود، مي باشد. در نهالستان هاي درختان ميوه، روش معمول ازدياد روش پيوند جوانه، به ويژه پيوند شكمي يا پيوند تي (T) از نوع خواب مي باشد.
پيوند شكمي
اين گونه پيوند، بيشتر ا ز ساير انواع پيوند جوانه مخصوصا " در نهالستان ها مورد استفاده قرار مي گيرد. روش كار بدين ترتيب است كه در پايه، برشي عمودي به طول 5/2 سانتي متر زده مي شود سپس در بالا و عمود بر اين برش يك برش افقي در پوست ايجاد مي شود (به طوريكه به شكل T درآيد ) براي تهيه ي پيوندك از گياه مادري مورد نظر نيز، دو برش كماني شكل در پوست اطراف جوانه (در روي شاخه ي سبزي كه پهنك برگ كنار جوانه قطع شده و دمبرگ آن باقي گذاشته شده است ) ايجاد كرده و با فشار انگشت شصت به طرف كنار، پيوندك جدا مي گردد . پيوندك را از بالا وارد شكاف ايجاد شده در پوست پايه كرده، به سوي پائين مي برند تا جفت شود . سپس آنرا با نوارهاي پلاستيكي ويژه اي ن كار، يا با مواد مشابه مي بندند. اين نوار نبايد آنقدر محكم بسته شود كه به پوست پايه صدمه برساند . در صورتيكه زمان پيوند آخر بهار باشد پس از ٢ روز، پايه را از 5-7 سانتي متري بالاي محل پيوند، و پس از ١٠ روز از بالاي محل پيوند قطع مي كنند.