مخلوطهاي ويتاميني پودري شديداً جاذب الرطوبه ميباشند و ميبايست از رطوبت هوا محافظت شوند. پس از بازكردن درب بطريهاي شيشهاي حاوي مخلوط ويتاميني، باید مطمئن شد كه كاملاً بسته شدهاند. مخلوط ويتاميني پودري در 8-2 درجه سانتيگراد نگهداری شده و از بسته بودن درب آن باید اطمینان کامل داشت.
9-2- تهيه محلولهاي پايه ويتامين[2]
- تقريبا 90% حجم نهايي مورد نياز آب مقطر يونزدايي شده را اندازهگيري نموده و در ظرفي كه میبایستي دوبرابر اندازه حجم نهايي محلول است ريخته شود.
- در حال بههم خوردن آب محيط پودري اضافه شده و تا حل شدن كامل، آنرا باید بههم زد. ممكن است نياز به افزايش دما يا pHباشد (32-35 درجه سانتيگراد).
- ظرف شيشهاي اوليه با آب مقطر يا آب يونزدايي شده شستشو داده تا اثرات پودر ازبين برود و آب آنرا میبایست به محلول محيط كشت اضافه نمود.
- جهت حصول به حجم نهايي، آب مقطر يونزدايي شده اضافي به محلول محيط كشت اضافه میشود.
- محلول پايه x1000 تهيه شده ميبايست با غلظت 1ميليليتر بر ليتر محيط كشت اضافه شود تا غلظت نهايي مناسب ويتامينها در محيط كشت، حاصل شود.
محلول پايه x100 تهيه شده ميبايست با غلظت 10 ميليليتر بر ليتر محيط كشت اضافه شود تا غلظت نهايي مناسب ويتامينها در محيط كشت حاصل شود.
2-6 ظروف شیشه ای و پلاستیکی
اساساً کشت این ویترو را میتوان در ظروف شیشه هی و یا پلاستیکی در
اندازه ها و شکل های مختلف انجام داد.شیشه این مزیت را دارد که دارای دوام بیشتری است و میتواند اتوکلاو شود.پلاستیک به طور طبیعی عمر کوتاهی دارد(پلاستیک ارزان قیمت و معمولاً یکبارمصرف است)و همیشه برای مصرف در اتوکلاو مناسب نیست.دوام پلاستیک بستگی به مقاومت آن در برابر حرارت و نوع مواد شیمیایی تمیز کننده دارد.پلاستیک این عیب را دارد که اتیلن متصاعد میکند و تجمع اتیلن در ظرف برای نمونه ها زیان بار است.
نمودار6-1:مجموعه موادی که اغلب برای القای رشد و نمو به محیط کشت اضافه می شود.این مجموعه از آب ترکیبات آلی (سمت چپ)،ترکیبات غیر آلی (سمت راست)و گروهی از مخلوط مواد غیر مشخص (قسمت پایین)تشکیل می گردد.
نیازهای غذایی و هورمونی کشت بافت و اندامهای گیاهی |
||
آب |
||
PH
|
عناصر
پرمصرف کم مصرف
|
موادالی |
CO Fe N NI Zn P AL B K MO Mn Ca I Cu Mg S
|
قند اسیدهای آمینه ویتامین ها اکسین سیتوکینین تنظیم کننده های رشد جیبرلین اسیدآبسیسیکﻰ اتیلن |
|
عصاره ی مخمّر شیر نارگیل عصاره ی گیاهی مخلّوطی از موّاد غیر مشخّص کازیین هیدرولیز شده پیتون و تریپتون |
انواع مختلفی از شیشه ها وجود دارند که مصرف آنها میتواند با عواقب فیزیولیژیکی همراه باشد.در تحقیقات استفاده از پیرکس یا شیشه های مشابه(سیلیکات بر)توصیه میشود.شیشه های ارزان قیمت با کیفیت پایین میتواند کاتیون های سمی نظیر سدیم سرب و ارسنیک را در محیط آزاد کند.پیرکس ترجیحاً برای کار با پروتوپلاستها و کشت تک سلول و کشت مریستم توصیه شده است.در باغبانی عملی استفاده از ظروف شیشهای پیرکس گران قیمت ضرورتی ندارد.و اغلب میتوان از ظروف شیشه ای ارزان قیمت بدون هیچ گونه ضرری استفاده کرد.این موضوع از نظر اقتصادی حایز اهمیت است .از آنجا که ظروف پلاستیکی غالباً محکم بسته میشوند،باید توجه شود که باعث تجمع اضافی اتیلن یا CO2 نشود.
ظروف شیشه هی ذیل برای کشت بافت به کار میروند.
1-لوله های آزمایش (بعضی اوقات با سر پیچ)
2-پتری دیش
3-ارلن مایر(برای هر دو نوع محیط کشت مایع و جامد)
4-ظروف مشهور به استوارد( بطری های استوارد).steward flask
5-در باغبانی عملی حتی می توان از شیشه های شیر،آبمیوه و مواد غذایی استفاده کرد.
در آزمایشگاه های تجاری کشت بافت،خصوصاً برای ازدیاد گیاهان از انواع لوله ها (به خصوص پلاستیکی )،جعبه ها و غیره، استفاده میشود.چنانچه پلاستیک برای اتوکلاو کردن مناسب نباشد ،آن را در کیسه های پلاستیکی (بدون محیط کشت)قرار داده،سرشان را بسته و توسط اشعه گاما استریل مینمایند.انتقال محیط کشت استریل به این ظروف ،در داخل محفظه با جریان هوای استریل انجام میشود.
شکل و اندازه ی شیشه(یا پلاستیک) میتواند پیامد های مهمی داشته باشد.به عنوان مثال میتوان یک لوله آزمایش را با یک پتریدیش مقایسه نمود.لوله آزمایش دارای حجم نسبتاً زیاد وسطح تماس خیلی کم، است.و در نتیجه میزان تهویه و خشک شدن کاهش می یابد.به طوری که شانس محدودی برای آلودگی وجود دارد.از طرف دیگرپتریدیش دارای حجم کمتر و سطح تماس بیشتری است.تهویه آن مناسب،خشکیدن آن سریع تر،ولی امکان آلودگی آن خیلی زیاد است.بنا براین بستن درپتریدیش اهمیت بیشتری از لوله آزمایش دارد(با پارافیلم و غیره).
به طور کلی واقعیت این است که کشتهای در ظروف بزرگتر ،رشد و نمو (تکثیر)بهتری نسبت به ظروف کوچکتر دارند.احتمالاً این موضوع به دلایل زیر است:
1-حجم بزرگتر می باشد،و در نتیجه ،دقت لازم از نظر گازهای متصاعد شده ی سمی(اتیلن، CO2 و غیره)بیشتر است.
2-میزان بیشتری از مواد غذایی در واحد سطح ،در اختیار می باشد.پیریک و بوتر(داده های منتشر نشده)اخیراًدریافته اند که گیاهچه های گیاه (phalaenopsis) در ظروف شیشه ای،بهتر از لوله ای آزمایش،رشد میکنند.
3-6 آماده سازی محيط كشت
تعداد زیادی مواد و حتی در بعضی موارد،مخلوطی از مواد به محیط کشت اضافه میشوند.جهت احتراز از آلودگی ،لازم است که برای هر ماده از قاشق جدا گانه ای استفاده شود.همچنین ترکیبات مصرف نشده را هرکز نباید به شیشه های اصلی بازگردانید.غلظت یک ماده ی به خصوص را می توان بر حسب واحد های گوناگون بیان کرد.در زیر به اصطلاحات کلی اشاره میشود: