۵-۵-شستشوي ظروف شيشه اي

ظروف شيشه اي پس از استفاده بايد بلا فاصله در آب گرم قرار گيرند ، به خصوص هنگامي كه حاوي محيط كشت جامد بوده اند . چون اگر آگار به جدار فلاسك و ظروف آزمايشگاهي بچسبند ، جدا كردن آن بسيار مشكل خواهد بود .شستشو بايد حتي الامكان سريعتر انجام شود تا از چسبيدن محيط كشت به جدار ظرف ها جلوگيري شود . پس از شستشو (ترجيحا با آب گرم و صابون) ظروف شيشه اي بايد با استفاده از يك برس ، تميز شوند . براي شستشو ، ابتدا از آب لوله كشي شهري و سپس از آب بدون ملح يا آب مقطر استفاده مي شود و نهايتا بايد تميز بودن ظروف به دقت كنترل شود . ظروف شيشه اي ، بايد بلا فاصله خشك شوند تا احتمال آلوده شدن آنها كاهش يابد چون ميكرو ارگانيزم ها براي رشد و توليد مثل به آب نياز دارند .

لوله هاي ازمايش به طريق زير تميز مي شوند:

ابتدا درب لوله ها برداشته شده و آگار و مواد گياهي ، با يك انبر بلند بيرون آورده مي شوند سپس زير جريان اب داغ به كمك برس ديواره اي لوله ي  آزمايش از داخل و خارج تميز مي شوند . بديهي است استفاده از ماشين ظرف شويي بسيار اسان تر است شستشوي نهايي ، با آب بدون ملح انجام مي شود . بهتر است ظروف شيشه اي قبل از اينكه مجددا مورد استفاده قرار گيرند ، استريل شده و به سرعت خشك و در يك محفظه ي استريل نگهداري شوند ( داخل يك قفسه ي عاري از گرد و غبار و به صورت سر وته )

۶-۵- روباتها(ادمهاي مصنوعي)در ازمايشگاههاي كشت بافت

دي براي(1986)اخيرا در يك مقاله ي تحليلي به سؤال زير پاسخ داده است:چرا در كشت بافت از روبات استفاده نمي شود.وي روباتها را به طور كلي شرح داده است(تاريخچه،توسعه وطبقه بندي)ساختمان كلي رباتهاوسيستمهاي بهره برداري ،انواع اجزاي حساس ،بينايي روباتهاوهمچنين كامپيوتر وهوش مصنوعي،در اين مقاله بررسي شده اند.دي براي همچنين موارد كاربرد (استفاده در كشاورزي،اتوماسيون ازمايشگاهها و استفاده در كشت سلولي وبافت)،اثرات بالقوه ي رباتها (مقايسه ي هزينه،طرز تلقي محققين در استفاده از انها) وبرتريهاي ديگر رباتها را شرح داده است. اين مقاله در برگيرنده ي اطلاعات ارزشمندي درباره ي امكانات بالقوه ي رباتها در حذف كارهاي پردرد سردر ازمايشگاههاي كشت بافت ،مخصوصا درتكثير گياهان،ودر كاهش هزينه هاي كارگري مي باشد.يك سيستم هوشمند روبات براي توليد گياهچه در روش اين ويترو،توسط دلبلانك همكاران شرح داده شده است دراين سيستم،گياهچه ها توسط روبات ،در محيط كشت گذاشته شده،از انجا برداشته وبه داخل ظروف مربوط (گلدان)منتقل مي شوند.

فصل ششم

تركيب و اماده سازي محيط كشت بافت

رشد و نمو اندامهاي جدا شده از گياه مادري در شرايط محيط درون شيشه تحن تاثير عوامل بسيار زياد و پيچيده اي قرار دارد كه بعضي از اهم انها عبارتند از:

1-     ساختار ژنتيكي گياه

2-     عناصر غذايي كم و پر مصرف، اب و قندها

3-     عوامل فيزيكي محيط رشد مانند نور، حرارت، اسيديته محيط كشت و غلظت گازهايي مانند اكسيژن و دياكسيد كربن.

4-     مواد الي مانند تنظيم كننده هاي رشد گياهي، ويتامين ها، پروتئين ها و ساير مواد.

خصوصيات ژنتيكي گياه يكي از عوامل بسيار مهم در موفقيت تكثير ان در محيط كشت بافت ميباشد.   اما حتي اگر گياه از لحاظ خصوصيات ژنتيكي امادگي رشد و نمو در محيط كشت بافت را داشته باشد بدون حضور مواد معدني و الي قادر نمي باشد كه در محيط اين ويترو رشد نمايد. بطور كلي عقيده براين است كه تمام گياهان و يا سلولهاي گياهان مختلف توتيپوتنت هستند و فقط شرايط محيط رشد انها در درون لوله ازمايش ميبايستي فراهم گردد تا انرا از خود بروز دهند.

قندها نیز باید به محیط کشت اضافه شوند، زیرا در این شرایط ،گیاه یا (قطعه گیاه)به طور کامل ، اتوتروف ((Autotroph يعني خودساز نیست.          

اهمیت عوامل فیزیکی رشد و نمو در شرایط این ویوو،به طور کامل برای حالت این ویترو نیز صادق است و به همان صورت ،اعمال میشود.این عوامل در فرایندهایی از قبیل جذب آب ،تبخیر،فتوسنتز،تنفس،رشد،گلدهی، ً

تشکیل میوه و غیره موثرند.

چهارمین فاکتور مهم ،گروهی از مواد آلی هستند که تنظیم کننده های رشد، به این گروه تعلق دارند.تنظیم کننده های رشد که در غلظت بسیار کم مورد احتیاج هستند،توزیع انواع مواد در داخل گیاه ،و بنابراین مسئولیت تقسیم سلولی ،رشد سلول  و غیره را بر عهده دارند.تنظیم کننده های رشد خصوصآ  اکسین و سیتو کینین،باعث نمو اندامها(تجدید حیات) در قسمت هایی از گیاه (قلمه یا ریز نمونه)که در محیط این ویترو،رشد یافته است،میشوند.همچنین این مواد در تولید جنین  در کشت سوسپانسیون سلولی حائز اهمیت فراوانند.                 58

بنابر این بسیار واضح است که تنظیم رشد و نمو یک گیاه فرایند پیجیده ای است که به ساختار ژنتیکی گیاه و همچنین به  محیط اطراف آن بستگی دارد. در زمان آماده نمودن محیط کشت ،بایستی اثرات متقابل این عوامل روی یکدیگر مد نظر قرار داده شود.

1-اثر متقابل مواد تنظیم کننده ی رشد با درجه حرارت :تغییرات در شکل گیری اندام ها ،میتواند بستگی به موجودیت (درون زا یا برون زا) اکسین یا سیتوکینین داشته باشد.بعضی اوقات ،غلظت اکسین یا سیتوکینین درون زا،شدیدًا تحت تاثیر درجه حرارت قرار می گیرد.

2-اثر متقابل نور و تاریکی ،با اکسین:IAA(ایندول استیک اسید)در نور،بیش از تاریکی تجزیه میشود.

3-اثر متقابل ژنوتیپ با مواد تنظیم کننده رشد:برخی ژنوتیپها برای رشد و نمو به غلظت زیاد ،و برخی به غلظت کم مواد تنظیم کننده ی رشد نیازمندند.توانایی بالقوه ی بیوسنتزیک هورمون خاص ،غالبا ً به صورت ژنتیکی  کنترل می شود.

4-اثر متقابل قند با نور:بعضی اوقات قند و نور می توانند موقتاً جایگزین یکدیگر شوند.جای گزینی ،به ظرفیت فتوسنتزی  در شرایط این ویترو نیز بستگی دارد.

قلمه ای که برای رشد و نمو در محیط این ویترو،قرار داده می شود، به موادّ متعددّی نیاز دارد، که این مواد در شکل 1-6 به صورت شماتیک، نشان داده شده است. این مواد، در حالت نمو در محیط این ویوو نیز مورد نیاز  می باشند (مثلاً آب،عناصر غذایی پرمصرف و کم مصرف). موٌادآلی و مخلوطهای غیر مشخٌصی که گیاه در حالت این ویترو نیاز دارد، الزلماً در رشد طبیعی، نیاز ندارد. به عبارت دیگر، گیاه در حالت این ویترو، هتروتروفیک (غیر خودساز) می باشد. در هر حال، مسلٌم است که آب، عناصر غذایی پر مصرف و کم مصرف، قند به عنوان یک منبع کربنه، و غالباً دو گروه از تنظیم کنندههای رشد(اکسین و سیتوکنین) در شرایط این ویترو، مورد لزوم هستند. چنانچه هر کدام از این ترکیبات موجود نباشد، معمولاً رشدو نموّی صورت نخواهد گرفت، و اندام یا بافت کشت شده در محیط این ویترو، از بین خواهد رفت. گاهی اوقات، اندام کشت شده، قادر است نیازهای خود را سنتز، و تامین کند. به طور مثال، اگر گیاهی در حالت این ویترو،احتیاجی به اکسین نداشته باشد، به آن گیاه، خود کفا ازنظر اکسین می گویند، که اکسین ساز نیز نامیده می شود. همان طوری که در شکل 6-1 نشان داده شده است، بعضی اوقات مخلوطهای غنی مشخٌصی برای القای رشد، اضافه می شود: معمولاً افزودن این مواد به محیط کشت، زمانی صورت می گیرد که محقٌق، از احتیاجات غذایی و هورمونی آن گیاه، آگاه نیست. امروزه،محیطهای کشت، اکثراً از مخلوطی از موادٌ مصنوعی به دست می آیند.مسّلم است که پیدا کردن یک محیط کشت متوازن که برای رشد بافتهای حاصل از تیپ خاّص گیاه(که در برسی منابع علمی هنوز گزارش نشده است)مناسب باشد،به وقت زیادی نیازمند می باشد. اگربه مخلوطی در حدود20 ترکیب مختلف مورد نیاز باشد، اغلب برای پیدا کردن نسبتهای صحیح از هر کدام به موارد خطا و اشتباه بر می خوریم.      

البته مقالات متعدّدی(گاترت1959، گامبورگ1976 ) درباره ی ترکیب عمومی محیط کشت وجود دارند،که اغلب کمکهای موثری می باشند.

اگر مادّه ژلاتینه، مثل آگار،به محیط کشت اضافه نشود،به آن، محیط کشت مایع،اطلاق می شود. کاربرد آگار،در بخشهای 6،4،2 آمده است.

برای افراد کم تجربه،انتخاب محیط کشت، مشکل است.بطوری که اغلب در مورد گیاهانی که د منابع علمی محیط کشت خاصّی برای آنها گزارش نشده، این سوال مطرح است که از کدام محیط کشت استفاده شود، در این مورد،

دی فوسارد(1976) پیشنهاد کرده است که آزمایش،با طیف گسترده انجام شود. وی، در این مورد،نتیجه گیری می کند که در یک محیط کشت، غالباً چهار گروه از مواد،جنبه ی حیاتی دارند:

از انجا که نیازهای گیاه مورد آزمایش، قبلاً مشخص نشده است،این چهار گروه از ترکیبات، در3غلظت( کم- متوسط- زیاد)پیشنهاد شده است:

1. قند(سازکارز): 1 ،2تا 4 در صد.
2. نمکهای پر مصرف(طبق گزارش موارشی و اسکوگ 1962) ¼تا ½میزان (غلظت کامل).                             
3. اکسین(مثلاً IBA ):01/5،0/0 تا5 میلی گرم در لیتر
4. سیتوکینین(مثلاًBA ): 01/5،0/0 تا 5 میلی گرم در لیتر

با توجّه به داشتن 3 غلظت متفاوت از هر کدام از 4ترکیب،نهایّه81=32گرم در لیتر،انجام ترکیب خواهیم داشت، که پس از آزمایش،از بین آنها،نوع اپتیمم برای رشد، انتخاب می شود.البته  درمرحله ی بعد، لازم است آزمایش های دقیق تری انجام دهیم: به عنوان مثال،اگر از آزمایشات سری اول، غلظت5/0 میلی گرم در لیتر اکسین غلظت اپتیمم بود، دراین مرحله، آزمایش را با مقادیر مختلف اکسین، بطور مثال: 05/0،1/3 , 0/0،5 /8،0/ 1،0و 5/1 میلی می دهیم.

روش دیگرآزمایش متنوع وسیعی از محیط های کشت است  که  به آن تکنیکMDA گویند. این تکنیک ،خصوصاً برای کشت پروتوپلاست

گونه های توتون Nicotiana)) و اطلسی( petunia )وبرای پروتوپلاست

 مزوفیل غلات ،کاربرد دارد.در این تکنیک از قطرات 40میکرومتری ،به عنوان واحد آزمایشی استفاده میشود.

ترکیب محیط های کشت مختلفی که غالبا در کشت سلول و بافت گیاهان و همچنين در طي اندام زايي و جنين زايي رويشي مورد استفاده قرار می گیرند ( مقادیر داده شده برای یک لیتر محیط کشت که با اب مقطر به حجم می رسد می باشند) بصورت زير تهيه ميگردند.

9-1- محيط­هاي پودري [1]

محيط هاي پودري شديداً جاذب الرطوبه مي باشند و ميبايست از تماس با رطوبت هوا محافظت شوند. پس از بازكردن درب بطريهاي شيشه اي حاوي محيط پودري، بايستي مطمئن شد كه درب آن مجدد كاملاً بسته شود. محيط هاي  خشك را ميبايستي در 8-2 درجه سانتيگراد و كاملاً بسته نگهداري نمود.

تهيه محيط كشت گياهي:

1. تقريبا 90% حجم نهايي مورد نياز آب مقطر يون­زدايي شده را اندازه­گيري نموده و می­بایست ظرفي دوبرابر اندازه حجم نهايي بكار برده شود.
2. در حال به­هم خوردن آب محيط پودري اضافه شده و تا حل شدن كامل، آنرا باید به­هم زد. برخي محيط­هاي پودري كندتر از ديگر محيط­ها حل خواهند شد. به­عنوان مثال، محيط پودري حاوي سولفات منيزيم (MgSo₄) كندتر از محيط حاوي سولفات منيزيم آبدار (MgSo₄.7H₂O) حل خواهد شد. اين يك پديده فيزيكي مي­باشد و حرارت دادن محلول ممكن است به­منظور حل نمودن پودر، مورد نياز باشد.
3.  ظرف شيشه­اي اوليه با آب مقطر يا آب يون­زدايي شده شستشو داده تا اثرات پودر ازبين برود و آب آن­را می­بایست به محلول محيط كشت اضافه نمود.
4.  در این مرحله مكمل­هاي دلخواه پايدار به گرما به محلول محيط اضافه می­شوند.
5.  جهت حصول به حجم نهايي، آب مقطر يون­زدايي شده اضافي به محلول محيط كشت اضافه می­شود.
6.  جهت ثابت نگهداشتن PH، از هيدروكسيد سديم، هيدروكسيد پتاسيم يا اسيد هيدروكلريك استفاده می­شود.
7.  بالاخره محيط كشت را در ظروف كشت توزيع کرده و پس از اتوكلاو­كردن، مكمل­هاي حساس به گرما اضافه می­گردند.
8. محيط در اتوكلاو قابل اطمينان با فشار 15 اتمسفر و دماي 121 درجه سانتي­گراد به مدت زمان مناسب استريل شود. دماي بالاتر ممكن است سبب ضعف در رشد سلول شود.
   • << قبلی
   • بعدی >>